Prinsip Eksperimen
Elektroforesis hemoglobin bertujuan untuk mendeteksi dan memastikan berbagai hemoglobin normal dan abnormal.
Karena perbedaan muatan dan titik isoelektrik dari jenis hemoglobin yang berbeda, dalam larutan buffer pH tertentu, ketika titik isoelektrik hemoglobin lebih rendah dari pH larutan buffer, hemoglobin membawa muatan negatif dan bermigrasi menuju anoda selama elektroforesis. Sebaliknya, hemoglobin yang bermuatan positif bergerak menuju katoda.
Di bawah tegangan tertentu dan setelah waktu elektroforesis tertentu, hemoglobin dengan muatan dan berat molekul berbeda menunjukkan arah dan kecepatan migrasi yang berbeda. Hal ini memungkinkan pemisahan zona yang berbeda, dan analisis pemindaian kolorimetri atau elektroforesis selanjutnya dapat dilakukan pada zona ini untuk mengukur berbagai hemoglobin. Metode yang paling umum digunakan adalah elektroforesis membran selulosa asetat pH 8,6.
Di dalam sitoplasma, gugus etilen glikol (CHOH-CHOH) yang terdapat dalam glikogen atau zat polisakarida (seperti mukopolisakarida, mukoprotein, glikoprotein, glikolipid, dll.) dioksidasi oleh asam periodik dan diubah menjadi gugus aldehida (CHO-CHO). Gugus aldehida ini bergabung dengan pereaksi Schiff berwarna merah keunguan yang tidak berwarna, membentuk pewarna ungu-merah yang mengendap di tempat polisakarida berada di dalam sel. Reaksi ini dikenal sebagai pewarnaan periodik asam-Schiff (PAS), sebelumnya disebut pewarnaan glikogen.
Metode Eksperimen
Bahan:Selulosa asetatmembran, peralatan elektroforesis(DYCP-38C dan catu daya DYY-6C), Alat Pemuatan Sampel Unggul (pipet), spektrofotometer, kuvet kolorimetri, buffer.
Penyangga:
(1) Buffer TEB pH 8,6: Timbang 10,29 g Tris, 0,6 g EDTA, 3,2 g asam borat, dan tambahkan air suling hingga 1000 ml.
(2) Buffer Borat: Timbang 6,87 g boraks dan 5,56 g asam borat, lalu tambahkan air suling hingga 1000 ml.
Prosedur:
Pperbaikan Solusi Hemoglobin
Ambil 3 ml darah yang mengandung heparin atau natrium sitrat sebagai antikoagulan. Centrifuge pada kecepatan 2000 rpm selama 10 menit dan buang plasmanya. Cuci sel darah merah tiga kali dengan garam fisiologis (750 rpm, sentrifugasi 5 menit setiap kali). Sentrifugasi dengan kecepatan 2200 rpm selama 10 menit dan buang supernatannya. Tambahkan air sulingan dalam jumlah yang sama, lalu tambahkan 0,5 kali volume karbon tetraklorida. Kocok kuat-kuat selama 5 menit, lalu sentrifugasi dengan kecepatan 2200 rpm selama 10 menit untuk mengumpulkan larutan Hb atas untuk digunakan nanti.
Merendam Membran
Potong membran selulosa asetat menjadi potongan-potongan berukuran 3 cm × 8 cm. Rendam dalam buffer pH 8,6 TEB hingga jenuh sempurna, lalu angkat dan keringkan dengan kertas saring.
Bercak
Gunakan pipet untuk menempatkan 10 μl larutan hemoglobin secara vertikal pada membran selulosa asetat (sisi kasar), sekitar 1,5 cm dari tepinya.
Elektroforesis
Tuangkan larutan buffer borat ke dalam ruang elektroforesis. Tempatkan membran selulosa asetat dengan sisi berbintik di ujung katoda ruangan. Jalankan pada 200 V selama 30 menit.
Elusi
Gunting zona HbA dan HbA2, masukkan ke dalam tabung reaksi terpisah, lalu tambahkan masing-masing 15 ml dan 3 ml air suling. Kocok perlahan untuk mengelusi hemoglobin sepenuhnya, lalu aduk.
Kolorimetri
Nolkan serapannya menggunakan air suling untuk larutan elusi dan ukur serapannya pada 415 nm.
Perhitungan
HbA2(%) = Absorbansi tabung HbA2 / (Absorbansi tabung HbA × 5 + Absorbansi tabung HbA2) × 100%
Perhitungan Hasil Eksperimen
Rentang Referensi untuk pH 8,6 TEB Buffer Selulosa Asetat Elektroforesis: HbA > 95%, HbA2 1%-3,1%
Catatan
Waktu elektroforesis tidak boleh terlalu lama. Membran selulosa asetat tidak boleh mengering selama elektroforesis. Hentikan elektroforesis bila HbA dan HbA2 terpisah dengan jelas. Elektroforesis yang berkepanjangan dapat menyebabkan difusi pita dan pengaburan.
Hindari menggunakan terlalu banyak sampel. Cairan hemoglobin yang berlebihan dapat menyebabkan pelepasan pita atau pewarnaan yang tidak mencukupi, sehingga menyebabkan peningkatan kadar HbA yang salah.
Cegah kontaminasi membran selulosa asetat dengan protein.
Arusnya tidak boleh terlalu tinggi; jika tidak, pita hemoglobin mungkin tidak terpisah.
Selalu sertakan spesimen dari individu normal dan hemoglobin abnormal yang diketahui sebagai kontrol.
Bioteknologi Liuyi Beijing memproduksi tangki elektroforesis profesional untuk elektroforesis hemoglobin yang merupakan modelnyaDYCP-38Ctangki elektroforesis membran selulosa asetat, dan ada dua model catu daya elektroforesis yang tersedia untuk tangki elektroforesis membran selulosa asetatDYY-2CDanDYY-6Ccatu daya.
Sementara itu, Bioteknologi Liuyi Beijing menyediakan membran selulosa asetat untuk pelanggan, dan ukuran membran selulosa asetat dapat disesuaikan. Selamat datang untuk meminta sampel dan informasi lebih lanjut kepada kami.
Merek Beijing Liuyi memiliki sejarah lebih dari 50 tahun di Tiongkok dan perusahaan dapat menyediakan produk yang stabil dan berkualitas tinggi di seluruh dunia. Melalui pengembangan selama bertahun-tahun, ini layak menjadi pilihan Anda!
Kami sekarang mencari mitra, baik tangki elektroforesis OEM dan distributor disambut.
Jika Anda memiliki rencana pembelian produk kami, jangan ragu untuk menghubungi kami. Anda dapat mengirimkan pesan kepada kami melalui email[dilindungi email]atau[dilindungi email], atau silakan hubungi kami di +86 15810650221 atau tambahkan Whatsapp +86 15810650221, atau Wechat: 15810650221
Waktu posting: 20 Sep-2023